Reinigung und Charakterisierung von mTMEM16A und der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors für die 2D-Kristallisation (PDF)

Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors
Der P2X7-Rezeptor (P2X7R) gehört zur P2X-Rezeptorfamilie ATP-gesteuerter
Kationenkanäle. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mit
zwei Transmembranregionen, einer grossen extrazellulären Schleife und intrazellulären N- und
C-terminalen Domänen. Drei Untereinheiten einer Isoform assemblieren zu einem
funktionellen homotrimeren Rezeptor. Aufgrund seiner Lokalisation in Zellen mit Beteiligung
an Schmerzentstehung, Entzündungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen ist der
P2X7R ein interessanter Angriffspunkt für die Entwicklungen neuer Arzneimittel gegen
verschiedene Krankheiten. Strukturell unterscheidet sich die 595 Aminosäuren umfassende
P2X7R-Untereinheit von anderen P2XR-Subtypen (P2X1R-P2X6R) durch eine um 120-200
Aminosäuren längere C-terminale Endodomäne. Funktionelle und biochemische Daten, die
von unserer Arbeitsgruppe zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Markwardt in Halle
publiziert wurden (Becker et al., 2008), lassen den Schluss zu, dass die C-terminale
Endodomäne des P2X7-Rezeptors ein Gating-Modul darstellt, wobei eine trimere Anordnung
des Moduls zur trimeren Struktur der P2X7-Rezeptoren passen würde. Modelle, wie solche
cytoplasmatische Domänen das Öffnen von Ionenkanälen regulieren, wurden bereits für
spannungsabhängige K+-Kanäle durch Kombination funktioneller Daten mit Kristallographie-
Strukturdaten abgeleitet. Die C-terminale Endodomäne des hP2X7-Rezeptors (hP2X7
355-595-
Protein) wurde in dieser Arbeit in der methylotrophen Hefe P. pastoris überexprimiert und
durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Optimierung der
Aufreinigungsbedingungen konnte ~1,5 mg hP2X7
355-595-Protein in hoher Reinheit pro Liter
Kulturmedium aufgereinigt werden. 2D-Kristallisationsversuche mit dem
His-hP2X7
355-595-Protein wurden in Kooperation mit Prof. Schmidt-Krey an der Fakultät für
Biologie am Georgia Institute of Technology in Atlanta im Rahmen eines einjährigen
Aufenthalts durchgeführt. Durch die Optimierung der Kristallisationsparameter Lipid-Protein-
Verhältnis (LPR), Salz sowie Temperatur wurde die Ausbildung von DMPC-
Membranstrukturen günstig beeinflusst und eine Abnahme von zuvor vorhandenen
Proteinaggregaten beobachtet. Nach elektronenmikroskopischer Auswertung der Proben
zeigte sich, dass es durch DMPC-Zugabe, in einem Lipid-Protein-Verhältnis von 1 bis 5, zu
einer Stabilisierung des His-hP2X7
355-595-Proteins kommt. Durch Zugabe von NaCl zum
Dialysepuffer konnte die Ausbildung von DMPC-Membranen gefördert werden. Eine
Rekonstitution des His-hP2X7
355-595-Proteins in die DMPC-Doppelschicht und eine
Ausbildung von kristallinen Bereichen konnte allerdings mit keiner der
Parameterveränderungen mit Sicherheit beobachtet werden. Die Optimierung weiterer
Kristallisationsparameter ist daher Gegenstand aktueller Untersuchungen.
Expression und Reinigung von TMEM16A für 2D-Kristallisationsexperimente
Die TMEM16A/Anoctamin-Kanäle konnten 2008 unabhängig von drei Arbeitsgruppen als
lang gesuchte Ca2+-aktivierte Chloridkanäle identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe
konnte mittels BN-PAGE-Analyse und Crosslinking-Experimenten erstmals gezeigt werden,
dass das in X. laevis-Oozyten und HEK293-Zellen exprimierte TMEM16A-Protein stabil zu
Homodimeren oligomerisiert und in homodimerer Form auch in der Plasmamembran dieser
Zellen vorliegt (Fallah et al., 2010, Molecular & Cellular Proteomics,). Ziel der fortführenden
Arbeit war es, das TMEM16A-Protein in Milligramm-Mengen zu exprimieren und zu
reinigen, um es für strukturelle Untersuchungen mittels der 2D-Kristallisation verfügbar zu
machen. Eine wichtige Frage war die Identifizierung von Detergenzien, die TMEM16A
schonend solubilisieren und gleichzeitig für die Kristallisation geeignet sind. Durch ein
umfassendes Screening konnte das nicht-ionische Detergenz C8E4 sowie das
Detergenziengemisch CHAPS und Triton X-100 als Detergenzien identifiziert werden, in
denen sich TMEM16A als stabiles Homodimer verhält. In anderen untersuchten nicht-
ionischer und zwitterionischen Detergenzien lag TMEM16A im nicht-denaturiertem Zustand
in unterschiedlichen prozentualen Verhältnissen als Monomer und Dimer vor. Durch
Kultivierung in einem Spinner-System im Litermassstab und affinitätschromatografischer
Aufreinigung gelang es, rekombinantes TMEM16A im Milligramm-Mengen in einer Qualität
zu isolieren, wie sie für die 2D-Kristallisation benötigt wird. Als weiteres Expressionssystem
neben HEK293-Zellen erwiesen sich Sf158-Insektenzellen als geeignet, Milligramm-Mengen
an homodimeren TMEM16A-Protein zu produzieren. Im Vergleich zu den in HEK293-Zellen
exprimierten TMEM16A wies das Protein in Insektenzellen ein anderes
Glykosylierungsmuster auf. Erste 2D-Kristallisationsexperimente mit dem aufgereinigten
TMEM16A werden zurzeit im Labor von Prof. Schmidt-Krey am Georgia Institute of
Technology durchgeführt.