Enss, D: Untersuchung von putativen Diaminoxidasen

Aus der Pyrrolizidin-Alkaloid (PA)-haltigen Pflanze Senecio vernalis wurden drei Diaminoxidasen (SVAO1, SVAO2 und SVAO3) identifiziert (Denker, 2008). Um diese auf eine mögliche Beteiligung an der PA-Biosynthese zu untersuchen, wurden SVAO1 und SVAO2 bereits in der Vergangenheit heterolog exprimiert (Denker, 2008). Im Rahmen dieser Arbeit wurde SVAO3 in E. coli heterolog exprimiert, was zu Inclusion bodies-Bildung führte. Auch eine Coexpression mit Chaperonen führte nicht zur Expression löslichen Proteins. Die bisherige Vermutung, dass es sich bei SVAO3 um eine kleine Gen-Familie handeln könnte, wurde bestätigt, da zwei weitere Vertreter dieser Familie im Rahmen dieser Arbeit identifiziert werden konnten.
Um über den Expressionsort der drei SVAOs auf deren Funktion schliessen zu können, wurden gewebespezifische RT-PCRs in S. vernalis durchgeführt. Dabei wurden Transkripte des svao3-Gens in allen Pflanzenorganen von S. vernalis, solche des svao2-Gens in Blatt und Spross und Transkripte des svao1-Gens nur in der Wurzel lokalisiert. Da sich die gesamte PA-Biosynthese in S. vernalis in der Wurzel befindet, wurde SVAO1 zum "hoffnungsvollsten Kandidaten" der drei SVAOs für eine mögliche Beteiligung an der PA-Biosynthese. Ebenfalls zur Lokalisierung der mRNA der drei SVAOs wurden in situ-Hybridisierungen in der Wurzel von S. vernalis durchgeführt. Mit einer Kombination von Sonden gegen mRNA des svao1- und svao3-Gens wurde ein Signal nahe dem Expressionsort der Homospermidin-Synthase, dem Eingangsenzym der PA-Biosynthese, detektiert. Daraus entstand die Vermutung, dass die gesuchte Diaminoxidase Strukturmerkmale von SVAO1 und SVAO3 besitzen könnte.
Um die Funktionen der drei SVAOs in planta zu untersuchen, wurden S. vernalis und Nicotiana tabacum mit Konstrukten zur Überexpression und Herunterregulation der Expression der drei SVAOs mittels Agrobacterium rhizogenes transformiert. Sowohl GUS-Tests, als auch PCRs mit der genomischen DNA der Hairy Root (HR)-Klone bestätigten